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產品名稱:

豬藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒

產品型號: 產品時間: 2023-07-05
豬藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒,采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR )技術檢測豬血清和組織中的PRRSV,適用于PRRSV的檢測、診斷和流行病學調查。
利用吸附柱提取RNA作為模板,在反轉錄酶的作用下,以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈;然后在DNA 聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環,使特異DNA 片段的拷貝數放大數百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、

產品概述

豬藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒使用說明書
【試劑盒簡介】
      豬藍耳病毒RT-PCR 檢測試劑盒,采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR )技術檢測豬血清和組織中的PRRSV,適用于PRRSV的檢測、診斷和流行病學調查。

 

【原理】
      利用吸附柱提取RNA作為模板,在反轉錄酶的作用下,以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈;然后在DNA 聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環,使特異DNA 片段的拷貝數放大數百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、染色后,在紫外燈下,肉眼可見DNA 片段的擴增帶。

 

【試劑盒組份】

1. 生理鹽水20mL8. 吸附柱和收集管10套
2. 裂解液6mL9. 0.2 mL 薄壁PCR 管15個
3. 洗滌液A7mL10. RT-PCR 反應液A180μL
4. 洗滌液B7mL11. RT-PCR 反應液B50μL
5. 洗脫液500μL12. 50 倍TAE 電泳緩沖液20mL
6. 陰性對照300μL13. 染色液10μL
7. 陽性對照300μL  

注:塑料袋內試劑(陽性對照、RT-PCR反應液A和B)-20 ℃凍存,裂解液2-8℃冷藏,其他室溫保存。

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【操作方法】
一、樣品制備
1樣品采集:病死或撲殺的豬,取肺、扁桃體和腦等組織;待檢活豬,用注射器取血5 mL,2~8 ℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴禁反復凍融。)
2樣品處理:
2.1 組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物;然后將樣品轉至1.5 mL滅菌離心管中,8000 rpm離心2 min,取100 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 全血樣品的處理:待血凝后取100 µL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對照的處理:取陽性對照 100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對照的處理:取陰性對照100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入450µL裂解液,充分顛倒混勻,室溫靜置3min 。
2. 加入275µL無水乙醇,輕輕混勻。
3. 將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質,以免離心時堵塞吸附柱),10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
4. 向吸附柱中加入500µL洗滌液A,10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
5. 向吸附柱中加入500µL洗滌液B,10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
6. 空柱10,000 rpm 離心2 min。
7. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中,在膜中央加入30µL洗脫液,室溫靜置2min,10,000 rpm 離心1min,獲得總RNA。
三、RT-PCR
1. 反應體系:分別取14µL RT-PCR反應液A(用前混勻)、4µL RT-PCR反應液B(用前混勻)和2µL模板RNA,混勻。
2. 反應程序:在PCR儀上運行以下程序:42 ℃ 45 min,94 ℃ 3 min ;94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s,35個循環;72 ℃延伸10 min。
四、電泳
1. 制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2. 電泳:待膠凝固后,取5µL PCR擴增產物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液中電泳。
3. 染色:取50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結果。

 

【結果判斷】
       陽性對照出現494bp擴增帶,陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品出現494bp擴增帶為豬藍耳病毒陽性,否則為陰性。

 

【需用但未提供的材料】
      組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經焦碳酸二乙酯(DEPC )處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭(10 µL、200 µL、1000 µL)。

 

【注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應在規定的溫度儲存,使用時拿到室溫下,使用后立即放回。
3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內試劑瞬離15s,使液體全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
4.嚴格按試劑盒說明書操作可以獲得的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
5.RNA提取過程中,應戴口罩、勤換手套,盡量縮短操作時間。
6.所有接觸病料的物品均應合理處理,以免污染實驗室。

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2)價格:價格實惠,量大從優,產品價格隨時會變動,實時報價還請來電獲取。
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